分光光度法繪制標準曲線常見問題解決方法

一、標準曲線

分析檢測中繪制標準曲線的目的是可以根據標準曲線查出待測物質的含量，所以標曲的制定是實驗室工作中必不可少的工作。

很多用戶對于標準曲線有很多疑問，例如做標準曲線真的那么簡單？你的標曲真的做好了嗎?導致標準曲線彎曲的原因是什么？RSD值、線性相關系數和線性方程如何？線性好與不好分別由于哪些原因造成的？是儀器、標液，還是配制的問題？

首先說明下前期測定時注意事項：

1、儀器校驗好。

2、移取液體體積要精確，保證迅速準確，盡可能用一根移液管；為減小人為誤差，同一種液體要一個人操作。

3、保證標準品的純度，所用標準品最好是新打開的，純度較高的固體或溶液，防止污染。

4、容器要保證潔凈。

5、根據標準品理化性質注意加樣的先后順序。

6、如果要測OD值，應保證測前各管液體充分混勻。

7、若還是有某個點誤差較大，應舍棄。

其次，還要了解如下知識：

1.樣品的濃度等指標是根據標準曲線計算出來的，所以首先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事，否則后面的實驗結果無從談起。

2、設置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度，即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內，包括上限和下限。而對于呈s型的標準曲線，盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內。

3、最好采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度，這樣就能夠保證標準樣品的濃度不會出現較大的偏離。

4、檢測標準樣品時，應按濃度遞增順序進行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準確性。

5、標準曲線的樣品數一般為7個點，但至少要保證有5個點。

6、做出的標準曲線相關系數因實驗要求不同而有所變動，但一般來說，相關系數r至少要大于0.98，對于有些實驗，至少要0.99甚至是0.999.

二、分光光度?法繪制標準曲線所遇問題

1、單色光純度不夠

問題：標準曲線上端向下彎曲。

措施：光度法中要求在最大吸收峰處測定吸光度，光度計的有效譜帶寬度越窄越好，有利于獲得純度高的單色光。

2.比色皿的厚度或光學性能不一致

如果裝試劑空白液的比色皿較其它比色皿薄或對光的吸收和反射少一些，則曲線的延線與縱坐標相交；反之，與橫坐標相交。

3.顯色反應和反應條件的問題

當顯色反應的靈敏度不高時，被測物低于某一濃度就不能顯色，當濃度不同時，溶液對光的吸收、散射的程度不同，低濃度段往往彎曲，加上濃度高時部分膠體顆粒的聚沉，致使測定的吸光度降低，曲線上端向下彎曲。

4.操作上的原因

問題：褪色反應，顯色溶液的顏色不穩定、易褪色，若比色時間超過了穩定時間，標準系列中高濃度溶液顏色減褪，致使曲線上端向下彎曲。

措施：控制好顯色劑的加入時間，可以每加3份，停3～3min，再加上3份，依次進行，以使每支比色管的顯色時間相近。

5、干擾物質的影響

三、標準曲線的檢驗

標準曲線的檢驗是實際操作中最大的難點，也是工作中誤區和爭議最多的話題，下面了解下最重要的三大檢驗項目：

1.精密度檢驗

標準曲線的精密度檢驗：精密度檢驗就是看試驗點距離擬合的直線的距離有無異常，所以也稱線性檢驗（擬合檢驗），需用F檢驗，P<0.05作為線性檢驗合格的標準。

2.截距檢驗

3.斜率檢驗

標準曲線的截距檢驗和斜率檢驗分別考察Y=a+bX中a和b與0的統計學差異，a與0有差別說明有試劑空白或系統誤差，而b若與0沒差別說明儀器的靈敏度根本達不到分析要求。

標準曲線的檢驗應該是線性檢驗結合失擬檢驗，以及殘差的正態性檢驗結合才是統計學上比較完備的。

（內容參考實驗與分析網）